一級生物安全櫃只可保護工作人員和環境而不保護樣品。其原理和實通分櫃類似，但是安全櫃的排氣口安裝有安裝過濾器。所生物安全櫃在排氣和進氣口都需要使用過濾器。一級生物安全櫃本身沒有風機，依靠外接通風管中的風機帶動氣流，但是因為一級生物安全櫃保護樣品，如今已鮮少有人使用。
二級B型生物安全櫃都是連接排氣系統的安全櫃。連接安全櫃排氣導管的風機連接緊急供應電源，在斷電下仍可保持安全櫃處於負壓狀態，不會市危險氣體泄漏出實驗室。
三級生物安全櫃是為4級實驗室生物安全等級而設計的，是目前安全防護等級最高的安全櫃。櫃體完全氣密，全排放式，一切氣體都不參與循環，工作人員則是通過連接在櫃體的手套進行實驗的，即手套箱，樣品通過雙門的傳遞箱進出安全櫃以確保不受污染，適用於高風險的生物試驗。
生物安全櫃的工作原理主要是將櫃內空氣向外抽吸，使櫃內保持負壓狀態，通過垂直氣流來保護工作人員；外界空氣經高效空氣過濾器過濾後進入安全櫃內，以避免處理樣品被污染；櫃內的空氣也需經過HEPA過濾器過濾後再排放到大氣中，可以有效的保護環境。
